大咖簡介

歐陽能太教授

現(xiàn)任中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科副研究員，細(xì)胞分子診斷中心副主任，于中山醫(yī)科大學(xué)取得醫(yī)學(xué)本科和病理碩士學(xué)位，德國慕尼黑科技大學(xué)取得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，在紐約醫(yī)學(xué)院和紐約州立大學(xué)完成博士后訓(xùn)練；曾分別任廣州醫(yī)學(xué)院附一院病理醫(yī)師、Texas A&M University毒理與腫瘤實驗室Scientist和紐約州立大學(xué)腫瘤預(yù)防研究所副教授；主要研究方向為腫瘤病理曾獲多項美國NIH研究基金。發(fā)表SCI論文50多篇以及Elsevier和Springer出版社Book Chapter多篇

NGS實驗室建設(shè)原則有哪些？

歐陽能太教授：NGS技術(shù)是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一項非常關(guān)鍵的技術(shù)。精準(zhǔn)診斷離不開分子診斷，而NGS技術(shù)是其中最難亦是應(yīng)用最廣的一項分子診斷技術(shù)。NGS技術(shù)相對比較復(fù)雜，需要一整套的系統(tǒng)工程才能完成，其中NGS實驗室的建設(shè)非常關(guān)鍵，也容易出現(xiàn)問題。

NGS實驗室的建設(shè)原則可參考我們這一領(lǐng)域的大咖李金明教授提出的一個原則，其稱之為“16字方針”，即各區(qū)獨立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作。前兩個原則涉及如何設(shè)置，后兩個原則則提醒注意不要走過頭，應(yīng)根據(jù)醫(yī)院的實際情況，注意工作的方便，不拘泥于標(biāo)準(zhǔn)。

我提醒大家需要特別注意第一點“各區(qū)獨立”。目前各個醫(yī)院對NGS技術(shù)的支持力度很大，但在建設(shè)NGS實驗室時需注意總體面積不宜過大，以免能耗消耗非常大。此外，在實驗室各區(qū)比例的設(shè)置上不要求平均比例，有的環(huán)節(jié)很小即可，有的環(huán)節(jié)可相對較大一些，即比例要合適。隨著醫(yī)院對NGS實驗室的支持力度越大，要求也越為嚴(yán)格，但有些醫(yī)院也出現(xiàn)走極端的情況，即分區(qū)非常多，房間數(shù)很多，但實際并不方便工作。應(yīng)注意類似步驟的合并，設(shè)置適當(dāng)?shù)姆块g數(shù)。

第二點，需注意風(fēng)向。其一，NGS實驗室應(yīng)使用全新風(fēng)系統(tǒng)，而不能使用普通家用空調(diào)。新風(fēng)系統(tǒng)可排出污染，而這是防污染最基礎(chǔ)的設(shè)置。其二，需注意整個房間的氣流方向應(yīng)形成對流才有效。

其三，目前出現(xiàn)問題較大的是生物安全柜、通風(fēng)柜和超凈工作臺這三種設(shè)備的合理配置使用。對于樣本的處理，需使用生物安全柜。生物安全柜通常使用A2級，不要太高級，30%外排即可滿足基本需求。B2級過高，100%外排，其實并不是很合適。超凈工作臺除了在試劑準(zhǔn)備間中可以使用外，其他地方不適宜使用。在所有環(huán)節(jié)中均使用超凈工作臺是不對的，因為超凈工作臺沒有外排功能，如果DNA氣溶膠一直在室內(nèi)循環(huán)是不合適的。而有的單位為了重視起見，所有環(huán)節(jié)，包括文庫構(gòu)建都使用生物安全柜，實際上也沒有必要。除了樣本處理間，其他地方使用通風(fēng)柜即可。相關(guān)注意事項很多，在此不一一贅述。

NGS質(zhì)量控制三大要點是？

歐陽能太教授：NGS技術(shù)是一項系統(tǒng)工程，質(zhì)量控制非常重要，主要的質(zhì)控點有三個，具體如下：

質(zhì)控點1：腫瘤樣本的質(zhì)控

第一個便是腫瘤樣本的質(zhì)控。在實際工作中有時會出現(xiàn)搞錯樣本的情況，或是前期診斷的失誤等。例如，對肺腺癌進行EGFR檢測，但如果拿到的是小細(xì)胞肺癌的樣本，則通常不做。其次，對樣本中癌細(xì)胞的數(shù)量要進行質(zhì)控。細(xì)胞數(shù)量太少，可能無法測出。雖說NGS靈敏度比較高，但仍有檢測下限。而癌細(xì)胞占比也很重要，如果癌細(xì)胞占比很小，而其他細(xì)胞占比很大，也會影響檢測靈敏度，此時需要進行富集。概而言之，即在腫瘤樣本的質(zhì)控上需注意腫瘤類型、癌細(xì)胞總體數(shù)量和占比。

質(zhì)控點2：文庫構(gòu)建

第二個質(zhì)控點是文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建是一個中間環(huán)節(jié)，即上機之前樣本是否準(zhǔn)備妥當(dāng)。主要涉及濃度和片段大小是否符合要求。濃度，一般使用Qubit測濃度即可；片段大小，通常用Agilent 2100做質(zhì)控。

質(zhì)控點3：數(shù)據(jù)

第三個質(zhì)控點是數(shù)據(jù)，即測序后下機的數(shù)據(jù)是否符合要求。因為前兩個步驟可能沒有發(fā)現(xiàn)問題，但最后測序卻不行。這其中涉及很多方面，包括測序儀本身運行是否正常等。數(shù)據(jù)質(zhì)控是最后一個質(zhì)控點，如果上述均無問題，則可進行后續(xù)的臨床分析和解讀。

歐陽能太教授：NGS技術(shù)非常強大，也是一項非常好的技術(shù)，其應(yīng)用于臨床也才剛剛起步，目前還有很多大醫(yī)院都沒有開展。我相信在未來NGS技術(shù)的應(yīng)用不論是使用的范圍，還是使用的深度都將有很大的發(fā)展。

NGS實驗室如何分區(qū)？

高通量測序（NGS）實驗室

目前高通量測序技術(shù)在臨床檢測上的應(yīng)用越來越廣泛，今天給大家簡單介紹一下NGS實驗室的建設(shè)和合理分區(qū)。

一、什么是高通量測序（NGS）技術(shù)？

高通量測序技術(shù)又稱NGS (Next Generation Sequencing) 技術(shù)，它是對傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)（即一代測序技術(shù)）進行了革命性的升級，可同時對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，使得轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診療實踐中，預(yù)示著疾病診療分子時代的到來。

二、什么是高通量測序（NGS）實驗室？

高通量測序檢測實驗室也叫NGS實驗室，是以高通量測序技術(shù)為檢測手段，來完成臨床疾病篩查、診斷或輔助診斷、腫瘤基因突變檢測等項目。高通量測序?qū)嶒灠�括濕桌實驗過程和干桌實驗過程，其中濕桌實驗是指實驗標(biāo)本預(yù)處理、核酸提取及其片段化、建庫、擴增、靶序列富集、混樣、測序前準(zhǔn)備及測序，干桌實驗是指測序后的數(shù)據(jù)分析、對比、注釋和結(jié)果報告等生物信息學(xué)分析流程。

由于NGS技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確；且NGS實驗要求高、影響因素多，實驗過程處理不當(dāng)也會導(dǎo)致檢測結(jié)果異常。因此一個嚴(yán)格有序、規(guī)范的NGS實驗室是非常必要的。

三、NGS實驗室設(shè)計原則有哪些？

1、各區(qū)獨立

實驗室各個區(qū)域無論是在物理空間上還是實際使用過程中，都應(yīng)當(dāng)處于完全分隔狀態(tài)，并且各區(qū)域之間不能有空氣的直接流通。

2、單一流向

NGS檢測通常涉及PCR擴增及核酸純化富集等過程，任何樣本源性污染、分析標(biāo)簽源性污染、擴增產(chǎn)物污染或氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，因此各實驗區(qū)域與緩沖間應(yīng)有一定的通風(fēng)壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染。

3、因地制宜  

新建實驗室除合理規(guī)范外，也要易于管理；若原有實驗室通過合理的規(guī)劃改造也能滿足質(zhì)量管理要求，亦可不必特地新建實驗室。

4、方便工作  

實驗室區(qū)域選擇及空間設(shè)計還應(yīng)最大限度考慮是否方便日常監(jiān)測工作，包括方便人員流動效率、大型儀器設(shè)備進出落地等。

四、NGS實驗室如何分區(qū)？

 NGS實驗室分區(qū)示意圖（引自李金明. 高通量測序技術(shù)）

1、試劑準(zhǔn)備區(qū)

本區(qū)域為潔凈區(qū)域，用于試劑的配制、分裝及少量儲藏等，需存放于此區(qū)域的試劑不可逆行由后續(xù)處理樣本的區(qū)域進入。另外，試劑盒中的陽性質(zhì)控品和對照品不應(yīng)貯存于此區(qū)域。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、純水儀、渦旋振蕩器、移液器和離心機。

2、樣本準(zhǔn)備區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，用于核酸的提取及濃度測定。在提取不同類型的樣本（新鮮組織、FFPE、血液等）核酸時應(yīng)避免樣本之間的交叉污染，建議在區(qū)域內(nèi)設(shè)置不同樣本的獨立的超凈工作臺。布局時應(yīng)注意高速離心機運行時產(chǎn)生的振動是否干擾其它設(shè)備等細(xì)節(jié)。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、核酸自動提取儀、高速離心機、水浴鍋、恒溫金屬浴、核酸定量儀、冰箱、移液器、渦旋振蕩器和磁力架。

3、文庫制備區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，用于文庫的構(gòu)建。NGS檢測時常見的文庫制備方法有雜交捕獲法和擴增子法，兩種方法均包含通過PCR放大文庫產(chǎn)量的步驟，因此在文庫制備區(qū)構(gòu)建文庫時，建議文庫擴增產(chǎn)物傳遞至下一階段區(qū)域（雜交捕獲區(qū)）進行純化及后續(xù)操作。另外，組織樣本進行捕獲法建庫時需要先對樣本做片段化處理，因此操作臺面規(guī)劃時應(yīng)區(qū)分片段化區(qū)域和建庫區(qū)域。

儀器設(shè)備：冰箱、生物安全柜、普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、超聲打斷儀、移液器、渦旋振蕩器和離心機。

4、雜交捕獲區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，用于文庫擴增后的純化，以及后續(xù)的二次擴增或捕獲富集等步驟。嚴(yán)防此區(qū)域擴增產(chǎn)物及氣溶膠等對其它區(qū)域的污染，盡量減少人員在該區(qū)域與其它區(qū)域之間反復(fù)頻繁流動，同時該區(qū)域的實驗物品、實驗服等盡量避免外帶。

儀器設(shè)備：普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、金屬浴、真空濃縮儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。

5、文庫擴增區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，對雜交捕獲產(chǎn)物進行PCR擴增富集，同時對上機測序前的文庫進行質(zhì)控，并且完成文庫上機前文庫最終的稀釋和混樣。

儀器設(shè)備：冰箱、普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。

6、測序分析區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，用于文庫的上機測序。此區(qū)域應(yīng)配備穩(wěn)定的供電設(shè)施及備用電源，并配備獨立的制冷設(shè)施保證測序儀在相對恒定的溫濕度環(huán)境下工作；還需開設(shè)適宜面積的機房用于放置服務(wù)器等，所配備的網(wǎng)關(guān)設(shè)備應(yīng)兼具穩(wěn)定性和安全性，確保數(shù)據(jù)有效、安全傳輸。

儀器設(shè)備：測序儀、服務(wù)器、穩(wěn)定電源。

7、電泳區(qū)

本區(qū)域為半污染區(qū)，用于核酸樣本質(zhì)量和文庫片段的分析。

儀器設(shè)備：冰箱、凝膠電泳、生物片段分析儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。

總之，一個規(guī)范的NGS檢測實驗室是獲得準(zhǔn)確檢測結(jié)果的重要保障，在實驗室運行過程中要始終堅持“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”的基本準(zhǔn)則。